网易体育4月10日消息

休斯敦火箭队今天坐镇主场丰田中心，迎战西部排名倒数第一的西雅图超音速队。主队1号球星麦格雷迪因为肩膀有伤，今日战术性休战，而“街球王”阿尔斯通成功伤愈复出并首发。结果超音速只是在第一节领先火箭5分，后三节完全处于被动挨打的局面，很快便落后20分以上，最终火箭103-80轻松战胜对手取得四连胜，本赛季4比0横扫超音速。本场过后，火箭队53胜25负暂时排名西部第五（战绩已跟马刺相同*排名规则请拉到文章最末端），主帅阿德尔曼成功超越了范甘迪去年的执教战绩（52胜30负），而超音速18胜61负继续在西部垫底。

火箭五人得分上双，顶替麦蒂首发的海德今天表现出色，11投7中砍下16分，阿尔斯通18分5次助攻3个篮板，斯科拉13分12个篮板完成两双，替补射手诺瓦克17分，布鲁克斯11分，海耶斯6分8个篮板，兰德里7分4个篮板，杰克逊7分。客队“榜眼”杜兰特得到全场最高的26分，沃特森16分，小威尔金斯14分，其余人完全梦游。四节的比分分别为：26-21、11-25、22-29、21-28（火箭队在后）。

阿尔斯通今天复出【点击查看比赛图集】

比赛开场后双方命中率都不高，阿尔斯通中路弧顶首次尝试三分不中，海德突破上篮首开记录，但杜兰特立刻扣篮还以颜色，双方开场前2分钟打成2-2平。此后海德爆发，连续突破上篮得手，帮助火箭打出一个9比2的小高潮，11-4迅速领先7分！杜兰特左翼三分线内一记中投，超音速6-11扳回2分，阿德尔曼在第一节还剩5分59秒时请求首次暂停。暂停后斯科拉、巴蒂尔连续4次罚球命中3分，火箭14-6保持领先。直到第一节还剩2分52秒时，杜兰特右翼27尺外投中三分，超音速15-19终于追了上来，紧跟着阿尔斯通三分远投偏出，客队打出一波8比0的冲击波！威尔金斯与杜兰特接连反击跳投得分，超音速23-19反超火箭4分！第一节最后7.8秒，阿尔斯通罚球勉强扳回2分，但小威尔金斯命中压哨三分，火箭21-26落后5分结束首节。

第二节火箭终苏醒，开场打了对方一个7比2！替补射手诺瓦克右翼投中三分、海耶斯上篮帮助火箭28-28成功追平，超音速见势不妙，在第二节还剩8分39秒时请求长暂停。暂停后威尔金斯高位跳投不中，又是海耶斯上篮、诺瓦克左翼三分连得5分！火箭33-28迅速反超。此时阿德尔曼开始大练兵，5名先发球员竟然没有一个在场上，杜兰特连续中投趁机将分差缩小到32-36。此时阿尔斯通、斯科拉等主力重新登场；第二节还剩2分30秒，海德左翼27尺外再次投中三分，此时11分火箭最高，主队39-33领先6分。之后火箭没有再让对方逆转，阿尔斯通在第二节最后34秒右翼出手三分中的，海耶斯最后6秒上篮得手，火箭46-37领先9分进入中场休息。

“榜眼”杜兰特得到上半场最高的13分3次抢断，小威尔金斯12分，但其他球员得分最高的沃特森只有4分；而火箭队海德11分最高、阿尔斯通10分5次助攻，诺瓦克三分球4投3中，得到9分3个篮板，海耶斯6分5个篮板。

下半场刚开场12秒，巴蒂尔左翼18尺外中投首开记录，火箭48-37领先11分！不过巴蒂尔很快就在防守杜兰特时阻挡犯规，榜眼连罚带投将分差40-48缩小。进行到第三节还剩8分钟整，穆大叔篮下强攻造成对方格林犯规，罚球2罚2中，火箭57-44一举领先13分，超音速见势不妙请求暂停。暂停后斯科拉罚球、补篮连续得分，海德上篮锦上添花帮助主队67-47整整领先20分，比赛似乎要进入垃圾时间。不过对方控卫沃特森连投带罚一口气得到5分，超音速52-67并不肯缴枪投降。直到第三节最后1分07秒，斯科拉突破上篮得手，火箭73-56仍领先17分！杜兰特和白人控卫里德诺连续罚球勉强追赶，超音速59-75落后16分进入第四节。

第四节完全变成垃圾时间，阿德尔曼又换下了全部主力，诺瓦克、兰德里等替补球员悉数登场。第四节还剩9分58秒，诺瓦克左翼底角再次命中三分（6投4中），火箭80-63保持领先，超音速也已无心恋战。第四节还剩5分54秒时，小个子布鲁克斯左翼三分中的锦上添花，火箭90-69遥遥领先21分！双方全部派上替补练兵，最终比分定格在103-80，火箭轻松迎来四连胜。

超音速先发：沃特森、杜兰特、杰夫·格林、克里森、艾尔森。

火箭队先发：阿尔斯通、海德、巴蒂尔、斯科拉、穆托姆博。

评论：榜眼不配和钻石争最佳 斯通切忌发神经

附-排行详细规则：

1）：胜差指该球队与所在分部领先者之间净胜场次之差除以2。

2）：东西部两个联盟的各前八名进入季后赛。同一联盟的三个分区第一名和一个成绩最好的分区第二名按战绩决定本分部前四名，剩下的四支球队按各自战绩排定名次。

3）：当两队胜场差相同时，依次按以下依据排出先后：

a 相互之间战绩好的居前 b 在赛区中的胜率高的居前（只在两队同属一赛区时适用） c 在各自联盟中的胜率高的居前

d 与所在联盟的其他前八名球队交手的胜率高的居前 e 与另一个联盟的前八名球队交手的胜率高的居前 f 得失分差高的居前。

3）当三队以上胜场差相同时，依次按以下依据排出先后：

a 相互之间战绩好的居前 b 在各自联盟中的胜率高的居前 c 在赛区中的胜率高的居前（各队同属一赛区时适用）

d 与所在联盟的其他前八名球队交手的胜率高的居前 e 得失分差高的居前。

看到一个深爱著你的人为你而改变 

因为爱你，他收起他的顽固脾气 

因为爱你，他把你的兴趣也变成是他的兴趣 

喜欢一个人是没有原因的

他无悔的付出，都认为是值得的 

只要能和相爱的人在一起

其实我们的身边都有一些这样的人

只是我们还没发现

最懂你的人，总是会一直的在你身边守护你

不让你有一丝的委屈 

真正爱你的人

不会说许多爱你的话却会做许多爱你的事 

如果你身边有这样的人的话 

请你好好珍惜

常因为你的小体贴而感动 

如果你一直对我好，我可能就会喜欢你

喜欢你的我，会毫不保留的付出 

天真的认为有天你就会懂

女生的心很容易受伤

所以我不轻易说出口，假如期望落空了

伤心难过很不好受 

总希望你先说，如果你也犹豫不决

或许我们就这样错过

再来後悔为何当初不说

摘不到的星星，总是最闪亮的 。

溜掉的小鱼，总是最美丽的。 

错过的电影，总是最好看的。 

失去的情人，总是最懂我的。 

这世界上，每一个人都有个想要寻找的人。 

这个人，错过了，就再也找不回来。 

如果爱上，就不要轻易放过机会。 

莽撞，可能使你後悔一阵子； 

怯懦，却可能使你一辈子後悔。 

没有经历过爱情的人生是不完整的， 

没有经历过痛苦的爱情是不深刻的。 

爱情使人生丰富，痛苦使爱情升华。 

多 少 个 早 知 道 已 经 来 不 及 ㄌ 

早知道 

早知道 

你过的不好 

我不会轻易让你离开 

早知道 

--我爱你--必须常挂在嘴边 

我不会吝啬说出它 

早知道 

--喜欢你--必须过马路时拉著你的手 

我不会介意伸出手来 

早知道 

--喜欢你--必须陪你逛百货公司 

在百忙之中我一定抽空 

早知道 

--我爱你--必须在吵架时依然讨你欢心 

即使错在於你 我可以颠倒是非 

早知道 

--我爱你--,--爱与被爱-- 

我不会选择--50%我爱你..50%你爱我- - 

会选择--70%我爱你..30%你爱我-- 

因为爱你多一点 你会倍感幸福 

早知道 

--我爱你--是半夜你来电时必须陪你讲通宵 

我不会跟你说--明天还要上班-- 

早知道 

--我爱你--是一种支持　 

我不会在你节食时.说你--无聊-- 

(因为你已够苗条美丽) 

早知道 

--你离开--後不是一种幸福 

我不会成全你和他 

早知道 

--上天安排--你离开是一种错误 

我不会让他得逞 

早知道 

--似曾相识--—我会趋前问清 

早知道---

早知道---

早知道---

--多少个早知道--都在你离去後 

跟著出来... 

可是...在多的早知道都以经没有用了 

都唤不回了...  

请珍惜身边爱你的人，结束。。

那一年，他对她的暗恋如一条长长的藤，一直在他的心里缠绕。那是一个阳春白雪般素净的女子。只一眼，他便知道，就是她了。
可是，他不敢诉说对她的爱恋。她的身边，有着太多的追求者。大多有着优异的条件。而他，似乎是其中最平凡的一个。他能给予她的太少太少。
他只是每天静静地注视着她。她的一频一笑都感染着他的情绪。他给她写情书，绵长绵长的思念，却从来不敢递给她。生怕她拒绝后，连默默注视的权力也没有了。
他知道她每天都是坐8路公车回家。于是，下班后，他便站在站台等，陪她坐同一班车。他总是坐在最后一排的位置上，这样可以肆无忌惮地看她。有时，她加班，他还是继续等，似乎是一个隐形的保镖。他希望每天的照面会让她能记住他的样子。哪怕只是记住也好。
那一天，下起了小雨。他和她各自站在一边等车。细雨纷飞，他的思索却全在她的身上。余光里，她安静的如一朵纯洁的马蹄莲。就在这个时候，他突然发现她的手链断了线，粉色的珠子霎时散落在已经泥泞的站台。他想也没想就跑过去捡那些珠子，然后掏出纸巾一颗颗地擦拭干净递到了她的手里。她温柔地说：“谢谢。”他的心却呯呯地乱跳了起来。这可是她对他说的第一句话。
接下来的日子，再碰到她。他总是鼓起勇气说：“好巧啊，下班啦。”然后，她便会对他微微一笑说：“是啊。”像一对萍水相逢的朋友。人少的时候，他们并排坐在双人位上讲一些琐碎的话。很多次，看着她下车的背影，他很想冲上去说：我喜欢你，暗恋了很久。可他始终没有这个勇气。
那天，也是一个雨夜。就在快下车的时候，她突然转过头看着他的眼睛说：“其实，我知道你是等我坐同一班车的。”他一时怔住，说不出任何话来。只听见她继续淡淡地说着：“可你知道吗？那串手链是我故意扯断的。”
时间在那一刹仿佛停止了转动，他的心里纠缠在一起。原来她一直心如明镜。
看着她起身要走。他终于一把握住了她的手。这样的场景，他曾在心里想象了无数遍。
夜是冰凉的，他的手心却渗出潮意。
他说：“可是，你也不知道吧？我的家在这趟车的反方向。”他孩子般羞涩地向她笑。
原来，他的爱，真得比她知道的还要更多。她流着泪，却微笑着反握住他的手。那一天，他们十指交缠，一直坐到了那趟车的终点站。
  本文来源于 人生网

2008-04-02 08:41:14　来源: 中国日报

资料图 美国媒体2007年3月25日称，世界第一只人兽混种羊在美国内华达大学的伊斯梅尔·赞加尼教授领导的研究小组诞生,目前羊体内的人类细胞比例达到15%，动物细胞比例为85%。

没有拍摄日期的照片显示用染色法标示出的人类胚胎干细胞群（中）。资料图

中国日报网环球在线消息：英国纽卡索大学4月1日宣布，已成功制造半人半兽混合胚胎，这是英国学术界的创举，议会将于下个月投票表决规范人兽胚胎研究的法案。

由阿姆斯特朗教授率领的研究团队在空的母牛卵子中，植入人类的脱氧核醣核酸(DNA)，这个人兽混合的胚胎已经存活了三天，未来将作为复制的基础研究，不会制造混合动物。

据英国广播公司(BBC)报道，这个写下生物史新页的人兽混合胚胎，目前含有三十二个细胞，研究人员希望它能继续生长到六天，再从胚胎中取出干细胞供研究使用。

在显微镜下，人兽胚胎里的细胞和其它仅成长三天的胚胎细胞无异。

针对人兽混合胚胎的研究，宗教界普遍反对，天主教会甚至批评是野兽行径，不过医学界和病患团体都支持这项研究，认为有助了解帕金森症和老人痴呆症等疾病。

研究人员指出，使用母牛的卵子而非人类的卵子，主要是人类的卵子十分珍贵而且来源有限，所有的胚胎将仅供研究使用，不会让胚胎成长时间超过十四天，取出干细胞后，将有助了解包括中风、糖尿病等多种疾病的肇因，并进而研发治疗方法。

纽卡索大学的这项研究事前已获得主管机关核发执照，下议院下个月将辩论新法案，对相关研究进行规范。(信莲） (本文来源：中国日报 )

——该研究成果3月19日发表在美国《公共科学图书馆·综合》

转基因农业给人类展示了美好前景，但由于缺乏有效的安全控制措施，转基因作物的试验和推广均受到严格控制，尚无法快速造福人类。日前，浙大农学院沈志成教授领衔的课题组发明了一种简单可控的转基因技术：通过该技术获得的水稻就像被打上了一个“烙印”，如“逃逸”出试验田与常规水稻混合，这种转基因水稻就会轻易“显形”并被除草剂除去，保证常规水稻的纯正性。这对提高转基因农作物的安全控制水平意义深远。该研究成果3月19日正式发表在在美国出版的《公共科学图书馆·综合》（PLoS ONE）杂志上，并申请了一系列国内外专利。

几十年来，全球科学家不断发明和完善转基因技术，可以轻易地在不同物种间转移特定基因。利用这种技术，我们可以使农作物具有抗虫、抗病、抗除草剂等功能，并且还可以把转基因农作物作为生物反应器，“生产”出胰岛素、猪疫苗等具有重大经济价值的药用和工业用蛋白质。但转基因作物的试验和推广存有潜在风险：因为转基因农作物在种植时，其外来转入基因有可能因花粉传播等发生“基因漂移”现象，转移到其他作物或者野生植物中，并且也会因为人为失误、动物活动等造成意外传播，使其混杂到常规粮食中，影响常规粮食的纯正性，带来不良后果。沈教授举例说，“比如一种‘生产’猪疫苗的转基因水稻混入了作为普通粮食作物的常规水稻中，即使对人体没毒性，也不适合大量食用。”因此，转基因农作物的试验和生产在各国都受到严格控制。美国一家大型生物技术公ProdiGene的一种表达疾病抗原蛋白质的玉米时因污染附近的农作物，被美国政府要求其全部收购、销毁所有可能污染了的农作物，并受到重罚。目前，仅仅依靠加强物理管理的方法，很难完全防止目的基因的漂移、传播和混杂。

沈志成教授长期以来从事传基因水稻的研发。他说，“转基因农作物的确是成功的现代农业生物技术之一，但好的技术如没有好的控制方法，可以产生预想不到的危害”。他在查阅资料时发现，农民常在稻田间使用除草剂苯达松，是因为水稻恰恰含有对这种除草剂的“解毒酶”，除草剂能杀死杂草，但对水稻无害。三年前，一次逆向思维启发了课题组：为何不在对水稻进行转基因操作时再加上一个“手术”，抑制这种基因的表达，这样处理过的转基因水稻就对苯达松这种除草剂失去了抗性。课题组进行了尝试，在研发抗虫水稻、含纤维素酶水稻、含乳铁蛋白水稻这些新品种的同时，利用RNA干扰技术抑制解毒基因的表达。经过这种技术获得的转基因水稻具有了一种“天生的缺陷”，对苯达松没有抗性，这与常规水稻正好完全相反。课题组进行了数次田间试验后发现，喷洒一次苯达松就能够把混杂在常规水稻中的这些转基因水稻全部消灭。

苯达松在除草的同时把转基因水稻也一并除掉，那转基因水稻田里的杂草怎么清除呢？沈志成说，有一种广谱的除草剂叫草甘膦，它能杀死杂草和常规水稻，只要在研发转基因水稻品种时转入抗草甘膦的基因，获得的转基因水稻就能不被草甘膦杀死。

课题组的这项发明被国外农业生物技术同行认为创意独特、方法巧妙并具有广阔应用前景。该研究主要完成人之一，浙大农学院博士生林朝阳说：“这项发明的优势不仅在于安全可控，还在于它可以结合在平时的杂草防治中，因此不增加成本。我们能简单地应用苯达松等防止杂草而同时达到杀灭生物反应器水稻的目的。”也就是说，本技术能够保证出口食品原料和出口种子的非转基因要求。这个项目的另外两个主要完成人徐晓丽和方军补充说，这个技术好像给转基因农作物带上了紧箍咒，一旦发现其逃逸，我们可以方便地控制它们。

目前，我国在转基因水稻方面投入了大量的研究力量，目前正在考虑进一步应用和推广转基因农作物。发展“可靠、简单和低成本”的转基因水稻和玉米控制技术是我国大面积推广转基因农作物的重要保障，也将是转基因产业的重要竞争基础。如果非转基因水稻将难于避免被转基因水稻混杂，将严重影响我国安全地利用转基因技术改良农作物，同时也影响以水稻为原料的食品向欧洲和其他国家的出口、影响我国出口东南亚水稻种子。沈志成教授介绍说，“这种发明将不仅仅运用在控制转基因水稻，我们也正在运用其原理发展可以控制的转基因玉米。”

作者：彭薇 来源：解放日报 时间：2008-3-26

——有望成为西瓜枯萎、辣椒疫病等难治病害的有效防治药剂

老百姓买青菜，出于对残留农药的顾忌，爱挑有虫眼的。上海交通大学生命科学技术学院许煜泉教授领衔的科研团队经过十余年研究，发现了一个能有效抑制植物病害的菌株，进而研制出微生物源“绿色农药”申嗪霉素。它既不会产生残留的化学有害物质，又能让瓜果蔬菜长得“漂漂亮亮”。该课题组研究成果日前获得上海市科技进步一等奖。

农民在种植瓜果蔬菜时常会碰到类似情况：辛苦种植了数月的甜瓜、甜椒等，因为得了一场“枯萎病”，植物茎蔓腐烂、根部萎缩，不开花也不结果，白种一场，损失不少。植物枯萎性病害，如甜瓜蔓枯病、辣椒疫病等，是农作物常见的多发病，给农业生产造成巨大损失。据统计，全国每年植物枯萎病害的发病面积在2500万亩次以上，产量损失达20%左右，经济损失数十亿元。世界上至今还没有找到有效抑制该病害的方法。

许煜泉团队经过多年研究，从植物根际土壤中筛选出一种假单胞菌株(M18)，其代谢产物能有效抑制由土壤“真菌”病菌引起的枯萎性病害，还能促进植物生长，农药定名机构将其有效成分命名为申嗪霉素。该团队在实验室利用M18菌株“生产”申嗪霉素，并开展了一些分析试验，获得产业化生产所用的高产菌株，并与传统发酵工艺优化技术结合。目前，团队又从M18菌株的代谢物中发现了另一种活性成分藤黄绿菌素，加上申嗪霉素，这是迄今世界上唯一报道的能在同一菌株中产生这两种抗生物质的菌株。在国际上，团队发表研究论文数十篇，M18菌株也获得国家发明专利。

目前，课题组与上海农乐生物制品公司合作生产的高效微生物源杀菌剂申嗪霉素已走向市场，在上海、江苏、浙江等六省一市的田间地头推广应用，累计使用面积达1610万亩次以上，按平均每亩次减少损失200元计算，估计产生的社会效益为32亿元。从各地试验收集的数据看，申嗪霉素用于防治辣椒疫病和西瓜枯萎病等具有良好效果，平均达75%以上。许煜泉教授透露，团队正继续研究，将申嗪霉素从瓜果蔬菜推广到水稻等大田作物，扩大农作物应用范围和面积，可创造出更大的经济和社会效益。

上海农药专业委员会主任徐子成教授表示：申嗪霉素是一种高效、低毒、安全，与环境相容性好的绿色农药，有望成为西瓜枯萎、辣椒疫病等难治病害的有效防治药剂，经济和社会效益显著，研究成果达到国际先进水平。

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在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。

    怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。

1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性

    寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：

第一个(5′)核苷酸  第二个核苷酸

 dA  dC  dG  dT

dA  －1.9  －1.3  －1.6  －1.5

dC  －1.9  －3.1  －3.6  －1.6

dG  －1.6  －3.1  －3.1  －1.3

dT  －1.0  －1.6  －1.9  －1.9

                          ΔG(kcal/mol)

    例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是：

  ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol

    此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的ΔG。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。

2. 选择引物的一般规则

    设计和选择引物时有5个要素必需注意。

2.1  引物的3′末端不互补     引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。

2.2  引物分子内不互补     应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

2.3  引物的组分、解链温度和长度    普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。

    要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。

2.4  引物的内部稳定性    在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

    如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。

    所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

2.5  引物的唯一性     为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。

    如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。

3. 按照氨基酸序列设计寡核苷酸

    按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试图“钓取”一个蛋白质的基因时。此时要注意的问题有：

    (1)宁可用简并引物，也不用猜测的引物。氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性，这比用猜测的密码子要好得多。有人用1 024个简并引物得到很好的结果。

    但是，应当避免在一个区域内有很高的简并性。但也有简并性低使引物不工作的报道。

    (2)引物与模板的错配。一般认为，所用引物与模板有15%～20%的错配，PCR的效果还能接受。但是，引物3′末端的错配比同样错配率的5′末端错配会引起更严重的问题。

    在最后4个碱基中有2个错配的引物，其 PCR产量急剧下降。但是，当核苷酸浓度高时，3′末端有错配的引物还能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L时，大多数3′末端错配引物可以接受，虽然非专一产物比较多，DNA合成的忠实性也下降。即使在低核苷浓度下，还会有少量从错配碱基出发的合成，因此，在开始的PCR循环中把退火时间增加到3～5分钟，比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。

    (3)在用唯一性引物时，建议用0.2 mmol/L或更低的总核苷酸浓度，因为高浓度会增加错误参入的比率。

    (4)简并寡核苷酸时，PCR应当在比较高的引物浓度下进行，即1～3 μmol/L而不是0.2 μmol/L，因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应，而只是产生高的背景而已。

技术

　互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

　　杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

　　核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 

第一节 核酸探针标记的方法

　　核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。

　　一、双链DNA探针及其标记方法

分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。

　　1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。

　　材料： 待标记的DNA。

　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

　　(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。

　　(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。

　　(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。

　　(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。

　　(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。

　　(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。

　　(7)10mol/L NH4Ac。

　　操作步骤:

　　(1) 按下列配比混合:

　　　　未标记的dNTP 10μl

　　　　10×切口平移缓冲液 5μl

　　　　待标记的DNA 1μg

　　　　[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl

　　　　E.coli DNA聚合酶 4单位

　　　　DAN酶 I 1μl

　　　　加水至终体积 50μl

　　(2) 置于15℃水浴60分钟。

　　(3) 加入5μl EDTA终止反应。

　　(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

　　[注意] 1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。

　　　　　2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

　　2. 随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

　　材料：待标记的DNA片段。

　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

　　(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。

　　(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。

　　(3)Klenow片段。

　　(4)20mmol/L DTT。

　　(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

　　(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。

　　(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。

　　操作步骤:

　　(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。

　　(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:

　　　　20mmol/L DTT 1μl

　　　　未标记的dNTP溶液 1μl

　　　　10×随机标记缓冲液 1μl

　　　　[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl

　　　　ddH2O 1μl

　　(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。

　　(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。

　　(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。

　　[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

　　　　　2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

　　二、单链DNA探针

　　用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; (2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。

　　1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。

材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。

　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

　　(1)10×Klenow缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。

　　(2)0.1mol/L DTT溶液。

　　(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。

　　(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。

　　(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。

　　(6) Klenow片段（5单位/ml）。

　　(7)适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。

　　(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。

　　操作步骤：

　　(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：

　　　　单链模板（约0.5pmol） 1mg

　　　　适当引物 5pmol

　　　　10×Klenow缓冲液 3ml

　　　　加水至 20ml

　　(2)将eppendorf管加热到85℃ 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；

　　(3)依次加入：

　　　　DTT 2ml

　　　　[a-32P]dATP 5ml

　　　　未标记的dATP 1ml

　　　　dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml

　　混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。

　　(4)加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。

　　(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。

　　(6)68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。

　　(7)加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小时。

　　(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L。

　　(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。

　　2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。

　　反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。材料：已提纯的RNA或mRNA

　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

　　(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。

　　(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。

　　(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。

　　(4)反转录酶(200000单位/ml)。

　　(5)100mmol/L DTT。

　　(6)250mmol/L MgCl2。

　　(7)1mol/L KCl。

　　(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。

　　(9)10% SDS。

　　(10)RNasin(40单位/ml)。

　　操作步骤:

　　(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：

　　　　RNA或mRNA 10.0ml

　　　　合适的产物(1mg/ml) 10.0ml

　　　　1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml

　　　　1mol/L KCl 3.5ml

　　　　250mmol/L MgCl2 2.0ml

　　　　5mmol/L dNTP 10.0ml

　　　　[a-32P]dCTP 10.0ml

　　　　0.1mol/L DTT 2.0ml

　　　　Rnasin 20U

　　　　加水至 48ml

　　　　反转录酶(200000单位/ml) 2ml

　　混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。

　　(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml

　　(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30分钟以水解RNA。

　　(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。

　　(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。 [注意] RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。

　　三、 末端标记DNA探针

　　现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。

　　1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。

　　2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。

　　3、试剂：

　　(1)3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。

　　(2)合适的限制酶。

　　(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。

　　(4)Klenow片段(5U/ml)。

　　(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。

　　4、操作步骤：

　　(1)25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。

　　(2)按下列成分加入试剂并混匀：已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液 5ml 2mmol/L 3种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量 加水至 50ml

　　(3)加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。

　　(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15分钟。

　　(5)70℃加热5分钟,终止反应。

　　(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50柱层析分离标记的DNA。

　　[注意]

　　1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。

　　2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。

　　3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。 　　四、寡核苷酸探针

　　利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。

　　1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。

　　2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。

　　3、试剂：

　　(1)10×T4多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。

　　(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。

　　(3)T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。

　　4、操作步骤：

　　(1)100ng寡核苷酸溶于30ml水中。置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。

　　(2)立即加入下列试剂：

　　　　10×激酶缓冲液 5ml

　　　　[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml

　　　　T4多核苷酸激酶 2ml

　　　　加水至 50ml

　　混匀后置37℃水浴20分钟。

　　(3)再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。

　　(4)Sephadex G-50柱层析。

　　此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。因此，建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。

　　除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。

　　五、RNA探针

　　许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。

　　噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。

　　反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。

　　另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。 

第二节 几种常见的杂交

　　分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：

　　(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。

　　(2) Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。

　　根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。

　　一、Southern杂交

Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:

　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。

　　(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。

　　(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。

　　(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。

　　(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。

　　Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。

　　将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

　　1、材料：待检测的DNA，已标记好的探针。

　　2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。

　　3、试剂：

　　(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。

　　(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。

　　(3)1×BLOTTO:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。

　　(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。

　　(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。

　　(6)0.2mol/L HCl。

　　(7)0.1% SDS。

　　(8)0.4mol/L NaOH。

　　(9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。

　　(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。

　　(11)硝酸纤维素滤膜。

　　(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L柠檬酸钠,用1mol/L HCl调节pH至7.0;

　　(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀释。

　　4、操作步骤：

　　(1) 约50μl体积中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括DNA分子量标准物)。

　　(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30分钟, 然后照相。

　　(3) 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml变性溶液两次,每次15分钟,倾去溶液; 500ml中和溶液30分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。

　　(4) 戴上手套,在盘中加20×SSC液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC液的3滤纸盖住滤膜,然后加上干的3滤纸和干纸巾,根据DNA复杂程度转移2-12小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。简单的印迹转移2-3小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。

　　(5) 去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。

　　(6) 将滤膜放入含6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12小时，弃去预杂交液。

　　(7) 制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5分钟。

　　(8) 在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。

　　(9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分钟, 两次。

　　(10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可见DNA谱带。对于≥108 cpm/μg从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg哺乳DNA中检测到10pg的单拷贝基因。

　　二、Northern杂交

　　Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。

　　1、材料：待检测的RNA及制备好的探针。

　　2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

　　3、试剂：

　　(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调pH至7.4，定溶到1L。

　　(2)其他试剂：与Southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC处理。

　　4、操作步骤：

　　(1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。

　　(2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。 　　(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。

　　(4) 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's试剂，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern杂交）。

　　(5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。

　　(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。

　　(7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。

　　[注意]

　　(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。

　　(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。

　　(3)RNA自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。

　　(4)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室温晾干。

　　(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。

　　(6)如用中性缓冲液进行RNA转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。

　　 三、菌落原位杂交

　　对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。

　　1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。

　　2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。

　　3、试剂：

　　(1)LB固体培养基。

　　(2)0.5mol/L NaOH。

　　(3)1mol/L Tris·Cl。

　　(4)1.5mol/L NaCl。

　　(5)0.5mol/L Tris·Cl。

　　(6)预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。

　　(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。

　　(8)其余试剂：与Southern杂交相同。

　　4、操作步骤：

　　1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：

　　(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。

　　(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。

　　(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。

　　(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。

　　(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。 　　(6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。

　　2. 菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜

　　(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。

　　(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。

　　(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。

　　(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。

　　(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定DNA。

　　(6) 将固定在膜上的DNA与32 P标记的探针杂交。

　　５.杂交

　　(1) 盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5分钟。

　　(2) 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。

　　(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。

　　(4) 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2小时。

　　(5) 将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

　　(6) 杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。

　　(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次,每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。

　　(8) 把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。

　　(9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。

　　(10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。

　　四、斑点杂交

　　斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。

　　1、材料：待分析的DNA或RNA样品，已标记的探针。

　　2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。

　　3、试剂：

　　（1）100% 甲酰胺。

　　（2）甲醛(37%)。

　　（3） 20×SSC。

　　（4）0.1mol/L NaOH。

　　（5）硝酸纤维素滤膜。

　　（6）滤纸。

　　4、操作步骤：

　　(1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。

　　(2) 用0.1mol/L NaOH清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC浸润1小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。

　　(3) 用10×SSC清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗两次。继续抽吸5分钟,吸干滤膜。

　　(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2小时。按上述Southern或Norhtern杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。

　　[注意]

　　 1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。

　　2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。 

第三节 杂交反应的条件及参数的优化

　　不同的反应条件对杂交结果的影响如下：

　　(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。

　　(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在68℃杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。

　　(3) 选用不同的封闭试剂：如Denhardt's试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。与Denhardt's试剂相比, BLOTTO价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。

　　(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。

　　(5) 在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探针的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。

　　(6) 根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）, 反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行。解链温度(melting temperature, Tm )是指在双链DNA或RNA分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G·C碱基对的序列比富含A·T碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm的计算方法，请参考第八章。

　　(7) 根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。

　　(8) 在水溶液中杂交时,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。

Trizol试剂

最低的价格－生工一贯的理念

最好的质量－生工不懈的追求

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Trizol试剂

 

SK1311	SK1312	BS409	BS410
25ml	100ml	25ml	100ml

注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4℃

简介：

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT-PCR、cDNA构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。

准备工作：

(1)  RNA酶(RNase)是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定。在一些极端的条件可暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。

(2)  RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。

(3)  塑料制品、玻璃和金属物品的处理

(a) 塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：

①  在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05% (后文中记作DEPC-H2O)。注意：DEPC为活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。

②  将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。

③  将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

④  灭菌塑料制品在合适的温度(80-90℃)下烘烤干燥。置洁净处备用。

(b) 玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上。

用户自备试剂：

DEPC、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇、糖原、液氮、RNase-free的离心管与Tips.

各种样品的最大使用量（1ml Trizol）：

样    品	最大使用量	样    品	最大使用量
动物细胞	1´107	动物组织	50mg
细    菌	1´109	植物组织	100mg
酵    母	1´107	丝状真菌	100mg

操作步骤：

1．在液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5-ml离心管中。细胞经计数后直接加入离心管，然后5,000 rpm 室温离心去上清。每100 mg组织或5´106个细胞加1.0ml的 Trizol。注意：如果组织量（1-10 mg）或细胞数很少（102-104），在样品中加入800 ml的Trizol，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原(终浓度为250mg/ml)，剧烈振荡或用匀浆器匀浆。

2．用1ml针筒，26-G号（6#）针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5-ml 离心管中。

3．加入200ml氯仿/异戊醇(24∶1)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。

4．   台式离心机上，12,000 rpm，室温离心5分钟。

5．将上清液小心转移到RNase-free 1.5-ml 离心管里，加入等体积的异丙醇，室温下放置5分钟。(注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。)

6．   台式离心机上，12,000 rpm，室温离心5分钟。

7．  小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。

8．用70% 酒精洗涤两次，每次700ml，12,000 rpm，室温离心2分钟。

9．尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。

10．真空离心干燥3-5分钟，或放在室温下使酒精完全挥发。

11．沉淀用30-50 ml DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10分钟。对于胰腺,肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。

12. DNA的分析和定量：

(1) 测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按1 OD=40mg RNA计算RNA的产率: OD260/280 在1.8-2.0视为抽提的RNA的纯度很高。若需精确量化，只有浓度在4µg/ml以上的样品适于用光度计测定。

(2) 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

注意：很少量的样品中加入糖原以提高RNA的产率。糖原(<4mg/ml)的存在，不影响cDNA第一链的合成，也不影响PCR。

Southern印迹杂交（Southern blot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（1）琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分离开，分离大分子DNA片段（800-12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%），300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质，分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5，曝光20-40s。

（2）硝酸纤维素膜吸印。

[1]将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。

[2]将胶片放进盛有变性缓冲液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盘中轻晃15min。

[3]换到中和缓冲液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盘中轻晃30min。

[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10×SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。

[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10×SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3mm滤纸充分饱和。

[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。

[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

[8]膜上放一张3mm滤纸，不能与胶接触。

[9]上面加吸印纸及重物（500g左右）。

[10]通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。

[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出，在6×SSC中洗一下。

[12]自然干燥，80℃烤2h。

[13]这是的膜就可进行杂交，或室温密封保存。 

Southern 杂交鉴定1）  取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶,)

2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照

记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。

3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)

A．  将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。

B．用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

C．将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。

D．将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

   重复D一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。

4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台

5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。

另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。

准备10 X SSC 转移液。

将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。

6）安装毛细管转移装置

A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。

B．将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。

D．用保鲜纸封住凝胶四边。

E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一

玻璃板，其上压一重物。

G．转移几小时或过夜(至少4小时)

注意：勿使转移液干枯。

7)已转移的DNA与膜交联

A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。

B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。

C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。

此膜可在4oC长期保存。

8)DNA探针的制备(略过)

参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。

9）印迹的预杂交

将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42 oC预热。

放入印迹膜,在42 oC预杂交30min。

10)准备探针

水煮地高辛标记的探针5min使变性, 并立即放在冰上2min.

11) 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。

42 oC杂交至少4小时或过夜。

注意: 不要将探针直接加在印迹膜上，而应加在容器一角的预杂交液中

12）印迹膜的冲洗：

A．将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

B．  用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次,每次5min .

C．  用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC摇动洗膜2次,每次15min (用杂交炉).

13)免疫检测:

A.  用10mL冲洗液洗膜1-5min.

B.  膜在15mL阻断液中孵育30min

C.  膜和8mL抗体孵育30min

D.  在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min.

E.  在15mL检测液中平衡2-5min.

14)将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即

用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡, 但避

免使膜干掉. 室温孵育5min.

15)在37 oC孵育潮湿的膜10min,增强发光.

16)用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min.

(发光性能至少可持续48小时)

17) X-光底片的冲洗

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片

 动植物组织mRNA提取

　一、材料

　　水稻叶片或小鼠肝组织。

　　二、设备

　　研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

　　三、试剂

　　1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

　　2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

　　3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

　　4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

　　四、操作步骤

　　（一）动植物总RNA提取-Trizol法

　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

　　[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

　　（二）mRNA提取

　　由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

　　1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

　　2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

　　3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

　　4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

　　5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

　　6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

　　7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。

　　8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

　　9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

　　10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

　　[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

　　2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

1、实验目的

提取人体细胞的总RNA和mRNA。

2、本实验所需试剂

1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，

2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂，

3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,

4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，

5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。

3、实验流程

3.1 细胞总RNA的提取

1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。

2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。

3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。

4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。

5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。

6）、电泳。

3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）

1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。

2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。

3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。

4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。

5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。

6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。

7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。

8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。

9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。

10）、电泳。

4、mRNA的应用：

RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling)，RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)

植物病毒RNA提取

 大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

　　一、材料

　　提纯TMV病毒液（10mg/ml）。

　　二、设备

　　冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

　　三、试剂

　　TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。

　　四、操作步骤

　　1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml）400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

　　2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

　　3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

　　4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

　　5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

　　6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。

　　7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。

　　[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。

　　2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

PCR的优化

在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。

表1 PCR扩增的疑难解析

问题	解释	补救措施
目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。	无效引导或无效延伸	通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。 应用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反应混合液。 应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%）
目的产物条带在阳性对照管2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。	模板DNA不纯。	重新纯化模板DNA，用酚：氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的DNA样品溶解于水中（不含EDTA）。
在阴性对照管扩增出目的条带。	盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。	重新配置新的试剂。
扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。	根据一条或两条引物的非特异性引导。	缩短复性时间或增加复性温度。
扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带。	要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板DNA过量。	检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。 应用降落PCR和（或）热启动PCR。降低模板DNA的量。

对可能发生在PCR过程中的主要问题的解析

表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。

表2 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法

症状	可能原因	补救措施
扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。	试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。	在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。
	复性条件不是最合适的。	重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。 验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。
	被复性结合到模板上的引物不适合延伸。	优化MgCl2、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Cheng et al. 1994）。 应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。 重新纯化模板DNA以去除抑制物。 在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。 如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5% PEG6000或10%甘油）。 如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。 应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。
	变性不完全。	增加变性的时间或者设置更高的变性温度。
	两个引物之间的距离太大。	应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。
多种扩增产物条带		应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。 优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。 用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。 确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。
引物二聚体过量		应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（booster PCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。

northern Blot实验方法

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

（二）材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

（三）试剂

NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：

1． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

2． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

3． 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）

5．检查点样孔。

4. RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5. 电泳：

1. 将RNA样品小心加到点样孔中。

2. 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

3. 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6. 转膜

1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

2．用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。

8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)

12．将膜在-20℃保存。

7. 探针的制备

1．在1.5ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA(25 ng) 　　　　1ul

Random Primer 2ul

灭菌水 11ul

总体积：14ul

2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer 2.5ul

dNTP Mixture 2.5ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

Exo-free Klenow Fragment 1 ul

4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

5．65°C加热5min使酶失活。

8. 探针的纯化及比活性测定：

1．准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。

2．取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。

3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处

4．100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。

6．将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。

7．1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.

8． 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。　

9．预杂交：

1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。

10．探针变性：

1．用10 mM EDTA将探针稀释10倍。

2．90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。

3．短暂离心，将溶液收集到管底。

11．杂交：

1．加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

2．42℃杂交过夜（14~24hr）。

杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。

12．洗膜：

1．低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。

2．高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20min两次。

13．曝光：

1． 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

2． 检查膜上放射性强度，估计曝光时间

3． 将X光底片覆盖与膜上，曝光

4． 冲洗X光底片，扫描记录结果。

14．去除膜上的探针：将200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15．杂交结果

操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡

MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit         

BS249                  10 Reactions

BS250                 20 Reactions

Components:

Component	BS249 Reactions	BS250 Reactions
5´Reaction Buffer	50ml	100ml
dNTP Mix (10mmol/L)	30ml	60ml
Oligo-p (dT) 18 Primer (0.5mg/ml)	15ml	30ml
Random Primer p (dN) 6(2mg/ml)	15ml	30ml
RNase Inhibitor (20U/ml)	15ml	30ml
M-MuLV Reverse Transcriptase (20U/ml)	200U	400U
RNase-free ddH2O	1.5ml	1.5ml

Description

Using the first Strand cDNA Synthesis Kit, RNA is reverse transcribed into single-stranded cDNA (1). In this method,

 M-MuLV Reverse Transcriptase synthesizes the new cDNA strand at a site determined by the type of primer used: at the 3'-end of the poly (A)-mRNA when Oligo-p (dT) 18 is used as a primer, at nonspecific points along the RNA template when using the Random Primer p (dN) 6, or at a primer-binding site for a sequence-specific primer. The resulting first strand cDNA can then be used as a template for PCR.

Quality Control

The product is tested functionally using 12.5pg of total HOX RNA as the template for amplification of a 674-bp segment of b-actin mRNA (40 cycles). A minimum of 25ng of the RT-PCR product was obtained under these conditions.

Storage and Stability

All components are stable for at least one year when stored at –20℃. Avoid repeated freeze.

General Note

Getting started, please read all instructions before beginning the procedure. To minimize the risk of RNase contamination, autoclave all vessels and pipette tips that will be used in the cDNA synthesis reaction. Gloves should be worn at all times. Thaw RNase Inhibitor, and M-MuLV Reverse Transcriptase on ice. Thaw all other solutions at room temperature. Keep all reagents on ice after thawing. Briefly centrifuge all reagents before beginning the procedure.

Protocol for First strand cDNA synthesis

1.       Synthesis of First Strand cDNA Suitable for PCR Amplification

1.  Prepare the following reaction mixture in a tube on ice:

template RNA:

 total RNA                                      1~5mg

or poly (A)+ RNA                        0.1~0.5mg

or specific RNA                          0.01pg~0.5mg

primers:

oligo (dT) 18 primer (0.5mg/ml)                1ml

or random hexamer primer (0.2mg/ml)           1ml

or sequence-specific primer15*            20pmol

deionised water, nuclease-free up to           12ml

    2.  Mix gently and spin down for 3~5sec. in a microcentrifuge.

    3.  Incubate the mixture at 70℃ for 5min, chilled on ice 30 sec then collect drops by brief centrifugation.

    4.  Place the tube on ice and add the following components in the indicated order:

5×reaction buffer                4ml

                RNase inhibitor (20U/ml)        1ml

                dNTP mix (10mmol/L)           2ml

    5.  Mix gently and collect drops by brief centrifugation.

    6.  Incubate at 37℃ for 5min (at 25℃ for 5min if random hexamer primer is used). Add:

            M-MuLV reverse transcriptase (20m/ml)     1ml

Final volume                         20ml

7. Incubate the mixture at 37℃ for 60min (incubate at 25℃ for 10min and finally at 37℃ for 60min if the random hexamer primer is used).

    8.  Stop the reaction by heating at 70℃ for 10min. Chill on ice.

The first strand cDNA synthesised can be used directly for PCR. 

Notes:

①      Prior separation of poly (A)+ RNA from total RNA is not mondatory, however, doing so may improve yield and purity of the final product.

②      RNA sample must be free of contaminating genomic DNA.Unlike the oligo (dT) 18 priming, which usually requires no optimization,

③      The ratio of a random hexamer primer to RNA is critical in terms of the average length of cDNA synthesized in the reaction. Increasing the ratio of hexamer/RNA will result in the higher yield of shorter (approx 500 bp) cDNA, whereas decreasing this ratio will produce longer products.

④      Problems with secondary structure of GC rich mRNA can be alleviated by increasing the reaction temperature up to 45℃, although the yield of the cDNA synthesis products may be lower due to heat-sensitivity of M-MuLV RT.

⑤      For analysis of the reaction products cDNA should be radiolabelled with [32P]. For this purpose, add 10iC [alfa-32P]dNTP (e.g., dATP) to the reaction mixture prior to adding M-MLV RT. Stop the reaction by adding 1ml of 0.5mol/L EDTA and keep on ice.

⑥      The synthesized cDNA should be stored at -20℃.     

Analysis of First Strand cDNA Products

Only radiolabelled cDNA products can be quantitited or analysed by alkaline agarose gel electrophoresis.

Determination of the Yield of First Strand cDNA

1.     Spot 1ml your sample on two Whatman DE81 filters (1.5´1.5cm2).

2.     Dry the filters under a heat lamp. Keep one filter aside and use it directly for the determination of total radioactivity in the sample.

3.     Wash the other filter three times for 5min in 10ml of 7.5% (w/v) Na2HPO4·12H2O for removal of unincorporated dNTP; rinse with water, wash with acetone or 96% ethanol.

4.     Dry the washed filter under a heat lamp.

5.     Transfer and count both filters (unwashed and washed) in a radioactivity counter.

6.     Use the following formula to calculate the yield of first strand cDNA:

                                          Incorporated radioactivity

             (washed filter)

     cDNA yield (mg) =  ---------------------------------´mol dATP in the assay´4´MW                              

                                        total radioactivity

                              (unwashed filter)

If the final concentration of dNTP is 1.0mmol/L, then mol dATP in the assay (20ml) is 2×10-8mol. The quantity of the labelled dATP is comparatively low, so it could be neglected. However, in the case of the high specific activity cDNA synthesis, the final concentration of unlabelled dATP is 0.02mmol/L. For calculation of mol dATP in the assay, it is necessary to sum up the molar amounts of both unlabelled and labelled dATP. MW is the average molecular weight of nucleotide, which is equal to 330´106mg/mol. As all four dNTP are involved in the reaction, MW is multiplied by 4.

                                 cDNA yield (mg)

cDNA yield (%) =  ---------------------------- ´100%

                      RNA template (mg)                          

For example:

If